Novi model proučavanjaautofagije u stanicama leukemijskih linija
HR.3.2.01-0105. Istraživačke stipendije za profesionalni razvoj mladih istraživača i poslijedoktoranada
je stvaranje modela za istraživanje leukemijskih stanica genskom promjenom stanične linije akutne mijeloične leukemije. Stanice koje ćemo genski izmijeniti procesom stabilne transfekcije izražavat će fluorescentni biljeg zajedno s proteinom LC3 ili s proteinskom domenom koja se veže za lipid fosfatidilinozitol-3-fosfat (PI3P). PI3P i LC3 sudjeluju u različitim fazama procesa autofagije, mehanizma kojim stanica samostalno razgrađuje svoje dijelove u uvjetima nedostatka hranjivih tvari ili povećanog staničnog stresa.
Smatra se da autofagija ima značajnu ulogu u procesu nastanka tumora i tumorskog odgovora na terapiju. Fluorescentno obilježavanje omogućit će da pomoću konfokalnog mikroskopa pratimo lokalizaciju u stanici gdje se PI3P i LC3 pojavljuju nakon podražaja poput izgladnjivanja ili dodavanja spojeva koji potiču autofagiju kao i intenzitet nakupljanja PI3P i LC3 u stanici. Te informacije mogu nam olakšati razumijevanje puteva prijenosa signala u regulaciji procesa autofagije u leukemijskoj stanici.
Leukemijske stanične linije, s obzirom da rastu u suspenziji, puno su zahtjevnije od adherentnih stanica za proces transfekcije. Cilj ovog projekta je generiranje stabilno transficiranih leukemijskih linija u kojima ćemo moći proučavati promjene fosfatidilinozitol-3-fosfata (PI3P) u stanici te različite faze autofagije za čiju je inicijaciju bitan PI3P. PI3P se visokom specifičnošću veže za proteinske domene PX i FYVE te je, ako u stanicu trajno unesemo ovu gensku domenu, moguće pratiti i raspodjelu PI3P-a unutar stanice. To je moguće jer je genska domena od interesa vezana uz gen reporter GFP koji onda lako detektiramo pod fluorescentnim mikroskopom.
Osim ove dvije domene, u trećem modelu stabilno transficirane leukemijske linije protein LC3, koji je indikator autofagije, bio bi vezan za gen reporter mRFP-GFP. Prednost reportera mRFP-GFP je u različitoj osjetljivosti mRFP na kiselu sredinu u usporedbi s GFP. Naime, u kiseloj sredini kakva se nalazi u lizosomu dolazi do slabljenja (engl. quenching) fluorescentnog signala GFP-a te tako obilježeni protein umjesto žuto (zeleno+crveno) počinje svijetliti samo crveno. Budući da je lizosomska razgradnja jedan od ključnih koraka u procesu autofagije, takav marker bi nam omogućio da pratimo tijek (engl. flux) procesa autofagije u stanicama od interesa. Ovim projektom dobili bismo tri vrijedna modela leukemijskih staničnih linija, dva kojima bismo proučavali promjene PI3P-a u odgovoru na različite agense i jedan koji bi nam pokazivao tijek autofagije sve do lizosoma.
Ellson CD, Anderson KE, Morgan G, Chilvers ER, Lipp P, Stephens LR, Hawkins PT. Phosphatidylinositol 3-phosphate is generated in phagosomal membranes. Curr Biol. 2001;11:1631-5.
linkplazmid iz grupe dr. Haralda Stenmarka Pattni K, Jepson M, Stenmark H, Banting G. A PtdIns(3)P-specific probe cycles on and off host cell membranes during Salmonella invasion of mammalian cells. Curr Biol. 2001;11:1636-42.
linkLeukemijska linija U937 jedna je od rijetkih linija čije stanice sadrže mnoga obilježja monocita te je zbog toga korisna kao model za proučavanje diferencijacije monocita i makrofaga in vitro. Linija je izolirana 1976. godine iz pleuralnog izljeva 37-godišnjeg bolesnika oboljelog od difuznog histiocitnog limfoma. Stanice U937 rastu u suspenziji u mediju koji sadrži FBS, neovisne su o specifičnim čimbenicima rasta, vrlo rijetko adheriraju za druge stanice u kulturi te nije primijećen rast u agregatima. U kulturi, stanice U937 rastu s vremenom udvostručenja od 20 do 48 sati te pokazuju morfološka obilježja monoblasta. Po FAB klasifikaciji svrstavamo ih u skupinu akutnih monoblastnih/monocitnih leukemija (AML-M5).
Leukemijska linija HL-60 jedna je od najčešće korištenih humanih leukemijskih linija za istraživanje mehanizama proliferacije i diferencijacije hematopoetskih stanica. Linija HL-60 izolirana je 1977. godine iz krvi 36-godišnje pacijentice koja je bolovala od akutne promijelocitne leukemije. Stanice rastu u suspenziji u mediju koji sadrži fetusni goveđi serum (FBS, prema engl. fetal bovine serum) s vremenom udvostručenja oko 30-40 sati, te nisu ovisne o drugim specifičnim čimbenicima rasta, a na polukrutoj podlozi mogu stvarati kolonije. U staničnoj kulturi stanice izgledaju kao promijelociti i mijeloblasti, a znatno rjeđe kao mijelociti i nešto zrelije stanice nalik granulocitima. Citogenetski, stanice HL-60 nemaju tipičnu translokaciju t(15;17) te se stoga svrstavaju u skupinu mijeloblastičnih AML-M2, a ne promijelocitnih AML-M3.
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Ut enim ad minim veniam, quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat. Duis aute irure dolor in reprehenderit in voluptate velit esse cillum dolore eu fugiat nulla pariatur. Excepteur sint occaecat cupidatat non proident, sunt in culpa qui officia deserunt mollit anim id est laborum.
At vero eos et accusamus et iusto odio dignissimos ducimus qui blanditiis praesentium voluptatum deleniti atque corrupti quos dolores et quas molestias excepturi sint occaecati cupiditate non provident, similique sunt in culpa qui officia deserunt mollitia animi, id est laborum et dolorum fuga. Et harum quidem rerum facilis est et expedita distinctio. Nam libero tempore, cum soluta nobis est eligendi optio cumque nihil impedit quo minus id quod maxime placeat facere possimus, omnis voluptas assumenda est, omnis dolor repellendus. Temporibus autem quibusdam et aut officiis debitis aut rerum necessitatibus saepe eveniet ut et voluptates repudiandae sint et molestiae non recusandae. Itaque earum rerum hic tenetur a sapiente delectus, ut aut reiciendis voluptatibus maiores alias consequatur aut perferendis doloribus asperiores repellat.
At vero eos et accusamus et iusto odio dignissimos ducimus qui blanditiis praesentium voluptatum deleniti atque corrupti quos dolores et quas molestias excepturi sint occaecati cupiditate non provident, similique sunt in culpa qui officia deserunt mollitia animi, id est laborum et dolorum fuga. Et harum quidem rerum facilis est et expedita distinctio. Nam libero tempore, cum soluta nobis est eligendi optio cumque nihil impedit quo minus id quod maxime placeat facere possimus, omnis voluptas assumenda est, omnis dolor repellendus. Temporibus autem quibusdam et aut officiis debitis aut rerum necessitatibus saepe eveniet ut et voluptates repudiandae sint et molestiae non recusandae. Itaque earum rerum hic tenetur a sapiente delectus, ut aut reiciendis voluptatibus maiores alias consequatur aut perferendis doloribus asperiores repellat.